WWW.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |
-- [ Страница 1 ] --

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Н.Н. АХМЕТСАДЫКОВ, Г.С. ШАБДАРБАЕВА,

Д.М. ХУСАИНОВ

ТЕХНОЛОГИЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ

БИОЛОГИЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ

Допущено МОН РК ВУЗ в качестве учебника

Книга 2

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ,

ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЧЕНИЯ И

ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ

Алматы, 2013

1

УДК 378 (075.8):576.8 ББК 48 я 7 А17 Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М.

А17 Технология ветеринарных биологических препаратов: Учеб ник – Алматы: Изд-во "Агроуниверситет", – 374 с.

ISBN 978-601-241-218-5 В книге 2 учебника для студентов, изучающих курс технологии произ водства ветеринарных биологических препаратов, приведены материалы для проведения лекционных, лабораторных и практических занятий по вопросам производства биологических препаратов, применяемых для диагностики ле чения и профилактики болезней, вызываемых вирусами.

Учебник разработан на основе рабочей учебной программы, с исполь зованием материалов отечественных и зарубежных литературных научных источников, нормативных документов, личного опыта, и отвечает требовани ям высшей школы. Предназначается для студентов, бакалавров, магистран тов, аспирантов, ветеринаров, биотехнологов, медиков и практических спе циалистов, работающих в области производства и применения биологиче ских ветеринарных препаратов.

УДК 378 (075.8):576. ББК 48 я Рецензенты:

Заманбеков Н.А., доктор ветеринарных наук, профессор;

Сейдахметова Р.Д., доктор биологических наук Учебник рекомендован к изданию Ученым Советом Казахского нацио нального аграрного университета (протокол № 7 от 14.12. 2009 г.).

ISBN 978-601-241-218- © Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М., © Изд-во "Агроуниверситет",

ПРЕДИСЛОВИЕ

Обеспечение ветеринарной службы высокоэффективными конкурентноспособными отечественными лечебно-профилактичес кими препаратами - одна из главных задач в экономике и экологии страны. Выполнение данной задачи предусматривает проведение работ по технологическому и техническому переоснащению произ водства биопрепаратов на основе достижений биотехнологии.

Биотехнология - управляемое получение целевых продуктов полезных для народного хозяйства, медицины и ветеринарии с по мощью биологических агентов: микроорганизмов, вирусов, клеток животных и растений, ферментов и антител. Она базируется на ис пользовании современных методов исследований и технологий, разработке, новых биотехнологических процессов, способов их контроля и управления и определения путей их дальнейшего разви тия и оптимизации.

Программой мероприятий по развитию агробиологического комплекса, в частности биопромышленности Казахстана, является совершенствование существующих и разработка нового поколения биопрепаратов - поливалентных, комплексных, ассоциированных, субъединичных, синтетических и генно-инженерных вакцин, сыво роток и диагностикумов, препаратов для экстренной защиты жи вотных от особо опасных болезней, массовых форм применения.

Для серологической диагностики заболеваний (в реакции агг лютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и др.) используются различные антигены, получение которых основано на наработке биомассы и определенной обработке: инактивации, очистке, дезинтеграции, ок раске, выделении полисахаридно-полипептидной фракции и пр.

Кроме того, при диагностике и лечении заболеваний живот ных используются позитивные, лечебно-профилактические, анти токсические сыворотки и приготовленные из них иммуноглобули ны. В последнее время все большее распространение получают комплексные диагностические тест-системы для диагностики забо леваний, в частности для иммуноферментной диагностики (ИФА).

Книга 2 посвящена изучению технологии биологических пре паратов, применяемых для диагностики лечения и профилактики болезней, вызываемых вирусами.

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНЕЙ,

ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ

Бешенство (Rabies) - остро протекающая болезнь, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Восприимчивы все виды домаш них и диких животных, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных странах земного шара.

Открытие возбудителя болезни принадлежит Луи Пастеру (1881-1889) им же предложен метод аттенуации вируса бешенства и возможность анти рабических прививок.

В 1887 г. В.Бабеш, а в 1903 г. А.Негри обнаружили в ганглиозных клетках головного мозга погибших от бешенства животных специфические эозинофильные цитоплазматические включения.

Возбудитель болезни - вирус, относящийся к роду лиссавирусов семей ства рабдовирусoв. Как и другие рабдовирусы, он имеет пулевидную форму.

Длина вирионов - 180 нм, диаметр - 75 -80 нм. Вирус удается культивировать в развивающихся куриных и утиных эмбрионах, в культурах некоторых кле ток. Штаммы возбудителя бешенства, циркулирующие в природе (уличный вирус), патогенны для всех теплокровных животных. В наиболее высоких титрах вирус накапливается в центральной нервной системе зараженных жи вотных, особенно в аммоновых рогах и коре больших полушарий головного мозга, в мозжечке и продолговатом мозге. Высокий титр возбудителя бешен ства и в слюнных и слезных железах.

Вирус обладает двумя основными антигенными компонентами. Раство римый S-антиген (нуклепротеин капсиды) является общим для всей группы вирусов бешенства и ответствен за продукцию комплементсвязывающих, преципитирующих антител и антител, участвующих в реакции иммунофлюо ресценции. Инфекционный V-антиген (гликопротеид наружной оболочки ви риона) вызывает образование вируснейтрализующих антител, антигемагглю тининов и обеспечивает формирование иммунитета. Этот антиген типоспе цифический. На основе различий гликопротеидного компонента, выявляемых в реакции перекрестной защиты и реакции нейтрализации, в группе вирусов бешенства выделяют 4 серотипа. Абсолютное большинство полевых и лабо раторных штаммов относится к первому серотипу. Штаммы вируса осталь ных серотипов пока выделены только в Африке. Биологические свойства ви руса бешенства, как и других вирусов, подвержены естественной изменчиво сти. Установлено несколько биологических вариантов уличного вируса. Ча ще всего выделяют классические штаммы, которые медленно фиксируются, вызывают типичную картину бешенства. Штаммы уличного вируса, напро тив, быстро фиксируются и после короткого инкубационного периода вызы вают паралитическую форму болезни, при которой не обнаруживают телец Бабеша - Негри. Имеют определенные особенности штаммы вируса, выде ляемые при арктическом бешенстве («ликований») животных;

«болезни бе зумной собаки» в Западной Африке, при бешенстве крупного рогатого скота, распространяемом летучими мышами-вампирами в Центральной и Южной Америке. Они с трудом фиксируются и вызывают болезнь с преобладанием паралитических признаков. Отклоняются от классических и биологические свойства многих штаммов «лисьего бешенства» и тем более так называемых бешенствоподобных вирусов, выделенных от мышевидных грызунов в Цен тральной Европе и от землеройки, летучей мыши и насекомых в Африке.

К бешенству восприимчивы все виды домашних и диких теплокровных животных, а также и человек. Повышенной восприимчивостью отличаются дикие представители семейства собачьих (лисица, волк, шакал, енотовидная собака) и куньих, летучие мыши, грызуны многих видов, а также домашняя кошка. Менее восприимчивы человек, собаки, рогатый скот, лошади, очень слабо восприимчивы птицы. Молодые животные более чувствительны к ви русу, чем взрослые.

Впервые бешенство упоминается в XXIII в. до н. э. в Кодексе законов Древнего Вавилона. В 1804 г. Цинке установил заразную природу бешенства, а Галтье (1879) сообщил о значении нервных путей в распространении воз будителя бешенства в организме животного и человека и искусственно вос произвел болезнь у кроликов.

Луи Пастеру и его ученикам принадлежит открытие способа аттенуа ции вируса бешенства и антирабических прививок (1881—1885). В 1887 г.

Бабеш, а в 1903 г. Негри обнаружили в ганглиозных клетках головного мозга погибших от бешенства животных специфические эозинофильные цитоплаз матические включения.

Лабораторная диагностика является главной, подтверждающей в ком плексе диагностических исследований. Она заключается в исследовании го ловного мозга животных с целью выявления вирусного антигена в РИФ, РДП, обнаружении телец Бабеша - Негри и биопробе на белых мышах.

Быстрым и простым методом диагностики является выявление телец Бабеша—Негри. Положительный диагноз может быть поставлен через мин после доставки материала в лабораторию. Важное значение имеет обна ружение специфических телец-включений в слюнных железах.

Более длительным методом лабораторной диагностики является биоло гическая проба. Для заражения наиболее пригодны мыши-сосуны и кролики.

Точным экспресс-методом диагностики бешенства является метод им мунофлуоресценции. Он позволяет получить ответ в день исследования ма териала. Метод флуоресцирующих антител основан на микроскопии мазков отпечатков головного мозга, обработанных специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующими красителями.

Из серологических методов диагностики бешенства известны: реакция диффузионной преципитации в агаровом геле, реакция нейтрализации на мышах, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглю тинации, реакция торможения гемагглютинации, реакция иммунофлуорес ценции.

Технология получения высокоспецифичной гетерологичной Технология включает гипериммунизацию животных-продуцентов инактивированным, очищенным и концентрированным вирусом бешенства с адъювантом фосфатом алюминия и/или нуклеинатом натрия. Полученный на культуре перевиваемых клеток Vero и на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка вирус концентрируют адсорбцией на геле фосфата алю миния или ультрацентрифугированием, или методами ультрафильтрации и очищают через пористые кремнеземы или ионообменной хроматографией.

Для иммунизации используют антиген с индексом иммуногенности не менее 9,5 МЕ/мл, содержанием белка менее 200 мкг/мл, бычьего сывороточного альбумина менее 0,5 мкг/мл, клеток ПСХ и Vero менее 0,5 мкг/мл, клеточной ДНК 5,0-10,0 мг/мл, концентрацией ионов алюминия в антигене 0,2-1, мкг/мл, нуклеината натрия 0,002-0,5 мг/мл. Схема грундиммунизации - 1- инъекции антигена дозой 3-15 мл с интервалом 14-30 дней, на 45-60 день основной цикл иммунизации из 10-15 инъекций с интервалом 5-15 дней до зой антигена 5-70 мл. Далее продуцентов иммунизируют один раз в месяц дозой 20-70 мл, один раз в полгода проводят укороченный цикл иммуниза ции из 2-4 инъекций антигена с интервалом 5-15 дней дозой 20-70 мл. Техно логия позволяет получать гетерологичную антирабическую сыворотку с вы сокой специфической активностью.

Исследования по получению антирабической сыворотки были начаты еще в 1889 г., когда Babes и Lepp обнаружили в крови иммунизированных собак нейтрализующие вирус бешенства антитела, с тех пор многие работы были направлены на получение сыворотки, обладающей высокой активно стью.

Получение нативных сывороток с высокой концентрацией антител до биваются гипериммунизацией животных, т.е. применением интенсивных схем иммунизации, состоящих из многих циклов и инъекций антигена. Коли чество циклов, число инъекций в каждом цикле, дозы и способы введения антигенов определяются в каждом конкретном случае, исходя из особенно стей антигена, его состояния, вида животных-продуцентов и целевого назна чения сывороточного препарата. Существует прямая связь между силой ан тигенного раздражения и качеством антигена с уровнем накопления специ фических антител в крови животных. В то же время качество антигена в зна чительной мере зависит от штамма вируса, методов его культивирования и очистки.

Технология получения № 1.

В качестве антигена используют вирус бешенства штамм Внуково- адаптированный к перевиваемым гетероплоидным клеткам Vero, который добавляют из расчета 0,1 ЛД50/кл к культуре клеток Vero в концентрации тыс. кл/мл. Зараженные вирусом клетки соединяют с ростовой средой и культивируют в биореакторе с использованием микроносителей. После сме ны ростовой среды на поддерживающую среду делают сборы вируссодержа щей жидкости. Полученные сборы фильтруют через фильтр Кулагина с диа метром пор 0,45 мкм и инактивируют с помощью аппарата-иррадиатора ультрафиолетовых лучей.

Полученная вируссодержащая жидкость содержит белок в количестве 570 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 1,6 мг/мл, индекс иммуноген ности составляет - 2,01 МЕ/мл. Концентрацию и очистку вируса проводят ультрафильтрацией с последующей очисткой на колонке с пористым кремне земом в трис-фосфатном буфере с рН=7,8. К очищенному вирусу добавляют фосфат алюминия с концентрацией ионов алюминия 0,6 мг/мл и стабилиза торы: лошадиный сывороточный альбумин в конечной концентрации 0,5%, сахарозу 7,5%, желатозу 1% и лиофильно высушивают. Перед использовани ем антиген разводят в воде для инъекций. В полученном антигене индекс иммуногенности составил 19,8 МЕ/мл, количество белка - 98 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,2 мкг/мл, клеточная ДНК - 3 нг/мл. Этим антиге ном иммунизируют лошадь массой (330±25) кг. Грундиммунизация состоит из двух внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 5 и мл с интервалом 30 дней. Основной цикл начинается на 45 день и состоит из трех внутрикожных инъекций антигена дозой 5, 10, 15 мл с интервалом дней и семи инъекций с интервалом 7 дней с увеличением вводимой дозы ан тигена от 20 до 50 мл, который вводят внутрикожно и внутримышечно. Затем в течение полугода лошадь иммунизируют раз в месяц дозой 20-30 мл внут рикожно и внутримышечно, после чего проводят укороченный цикл иммуни зации, состоящий из трех инъекций антигена дозой 20, 25, 30 мл с интерва лом 14 дней внутрикожно и внутримышечно. Кровь брали на 20-й день после каждого цикла иммунизации. На 110-й день после завершения основного цикла в полученной антирабической сыворотке специфическая активность была 120,1 МЕ/мл, -фракция - 43,8%, антитела к клеткам Vero отсутствова ли. На 230-й день ревакцинации, после четырех однократных ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 172,1 МЕ/мл, фракция - 50,6%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 333 день иммуни зации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 183,0 МЕ/мл, -фракция - 56,3%, антитела к клеткам Vero - около 0,2 мкг/мл.

Технология получения № 2.

Штаммом вируса бешенства Внуково-32, с множественностью зараже ния 0,01 ЛД50/кл заражают трипсинизированные клетки почек сирийского хомяка в концентрации 500±100 тыс. кл/мл. Зараженные вирусом клетки со единяют с ростовой средой и культивируют в биореакторе с использованием микроносителей. После смены ростовой среды на поддерживающую делают сборы вируссодержащей жидкости. Полученные сборы фильтруют и инакти вируют. В исходной вируссодержащей жидкости иммуногенная активность составляет 0,55 МЕ/мл, белка - 500 мкг/мл, бычьего сывороточного альбуми на - 1,8 мкг/мл. Концентрацию и очистку вируса осуществляют методом ультрафильтрации с последующей очисткой ионообменной хроматографией на анионите ДЭАЭ-целлюлозе. Добавляют нуклеинат натрия в количестве 0, мг/мл, стабилизаторы и подвергают лиофильной сушке. В полученном анти гене индекс иммуногенности составил 10,3 МЕ/мл, белок - 100 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,3 мкг/мл, клетки ПСХ - 0,1 мкг/мл. Этим антиге ном, разведенным в воде для инъекций, иммунизируют быка массой (335±25) кг. Грундиммунизация состоит из трех внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 5, 10 и 15 мл с интервалом 20 дней. На 45 день на чинают основной цикл иммунизации, состоящий из 10 инъекций антигена с интервалом 7 дней с увеличением вводимой дозы от 5 до 50 мл и 5-ти инъек ций антигена дозой 50 мл с интервалом 14 дней. Антиген вводят внутрикож но и/или внутримышечно, в несколько точек на шее и крупе. В течение полу года быка иммунизируют раз месяц дозой 25-45 мл внутрикожно и внутри мышечно, затем проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из трех внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 20, 30 и мл с интервалом 14 дней.

На 150-й день после завершения основного цикла иммунизации полу чили антирабическую сыворотку со специфической активностью 83,1 МЕ/мл, в которой -фракция составляла 40,8%, антитела к клеткам ПСХ не выявля лись. На 240-й день ревакцинации, после трех ежемесячных инъекций анти гена, титр специфических антител составил 114,0 МЕ/мл, -фракция - 42,9%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 375 день иммунизации, после уко роченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 119, МЕ/мл, -фракция глобулина - 43,2%, антитела к ПСХ - менее 0,5 мкг/мл.

Полученные результаты представлены в таблице.

Таким образом, предлагаемая технология позволяет в производствен ных условиях получить высокоспецифичную гетерологичную антирабиче скую сыворотку со специфической активностью не менее 75 МЕ/мл, в кото рой -глобулиновая фракция составляет не менее 40%, антитела к клеткам субстрата, на котором происходил рост вируса, - менее 0,5 мкг/мл, пригод ную для получения гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Предлагаемый способ безопасен и высокоэффективен.

Технология получения иммуноглобулина диагностического Получение иммуноглобулина диагностического антирабического пре ципитирующего (ИДАП) включает иммунизацию животных-продуцентов ра бическим антигеном из вируссодержащей мозговой ткани, взятие крови с последующим отделением антирабической сыворотки и выделение имму ноглобулина, при этом в качестве продуцентов используют животное-самку, ее иммунизацию осуществляют рабическим антигеном, приготовленным из вируссодержашей мозговой ткани молодого животного, для иммунизации используют три вида антигена: НАФ – антиген, адъювант-депонированный и фенолизированный, а иммунизацию осуществляют комбинированием внут рикожных, подкожных и внутримышечных введений антигенов, с целью стимуляции антителогенеза вводят цитотоксическую сыворотку, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 °С в течение 30 минут, глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с после дующим диализом, центрифугированием и лиофильным высушиванием.

Стимуляция продуцентов антиретикулярной цитотоксической сывор откой повышает антителогенез. Использование трех видов антигенов с тремя различными путями введения способствует получению антирабической сы воротки с высоким содержанием преципитирующих антител, так как ак тивность антирабических сывороток во многом определяется контактом ра бического антигена с обширной сетью нервных окончаний, в результате этого, полученный иммуноглобулин не требует применения дорогостоящего оборудования и реагентов для дополнительной концентрации и очистки от неспецифических антител при изготовлении и применении иммунодиагно стикума для реакции диффузной преципитации.

А Техника получения антигена Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют ослят 1,5-2 - месячного возраста, матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см 1 %-ной суспензией вируса бешенства (штамм CVS). Суспензию готовят в стериль ных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного живот ного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тща тельно растирается в ступке пестиком, и готовят 10 % суспензию на 0,85 % растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из расчета но 500 ЕД. пени циллина и стрептомицина на 1 мл. Суспензию экстрагируют в течение 18 ча сов при 4 °С и из надосадочной жидкости делают разведение 1:10, которое и используют для заражения.

На 5-6 день после заражения, когда у ослят наступает атаксия, парали чи и агония, в асептических условиях извлекают головной мозг. Хранят мозг целиком в стерильной посуде при температуре минус 20 °С и используют по мере надобности.

Рабический антиген для иммунизации ослов применяют в 3-х вариан тах, основу которых составляет 4%-ная суспензия вирулентного мозга ослен ка на физиологическом растворе хлорида натрия.

Добавление к одной части суспензии 0.25 % фенола образует феноли зированный антиген. Другой – адъювантдепонированный антиген содержит в своем составе 0,05 % сапонина, 20 % гидрата окиси алюминия и 0,1 % формалина. Третий – НАФ антиген – в пропорции 1:1 с неполным адъюван том Фрейнда.

Б Техника иммунизации животных Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здо ровых, ослов, полученных из благополучных по инфекционным и инвази онным заболеваниям хозяйств.

Новорожденный молодняк заражают и получают антигенный материал по вышеприведенной методике.

В это время осла подвергают обработке стимулирующей дозой антире тикулярной цитотоксической сыворотки, трехкратно, с интервалом 7 дней в дозе 0,02 см на 50 кг живой массы тела.

Иммунизацию животных осуществляют чередованием внутрикожных, подкожных и внутримышечных инъекций рабических антигенов. Внутри кожные инъекции осуществляют 6 точек: слева и справа область шеи, спины, крупа;

подкожные и внутримышечные - в область шеи и крупа. Первона чально осуществляют грундиммунизацию: внутрикожно вводили НАФ антиген по схеме 0,26 (в 6 точек по 0,2 см), подкожно адъювантдепониро ванный антиген по схеме 2,02 (в 2 точки по 2,0 см в область шеи), внутри мышечно фенольный антиген по схеме 1,52 (в 2 точки по 1,5 см в область крупа).. На 45-е сутки после грундиммунизации приступают к гипериммуни зации, животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10-20 дней в за висимости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и анти септики. Вначале вводят НАФ-антиген и адъювантдепонированный анти ген соответственно в дозах 0,2мл10точек и 2мл2точки, инъекцию которого повторяют на 60-й (0,2мл15точек и 3 мл2 точки) и 75-й (0,2мл20точек и 4мл2 точки) и 90-й день (0,2мл30точек и 5мл2 точки). Фенольный анти ген вводят в область крупа, слева и справа – на 52, 67, 82 и 97-й день в на растающих дозах: 2мл2точки, 3мл2точки, 4мл2точки, 5мл2точки. На растание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой ин дивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и РН.

На 10 день после последней инъекции антигена (107 день от начала иммунизации) у ослов осуществляют пробное крововзятие по норме 400 см на 100 кг живой массы.

При достижении преципитационного титра 1:32-1:128 через 14 дней (118 день от начала иммунизации) производится следующее крововзятие по полной производственной норме (1800 см3 на 100 кг живой массы). Вирус нейтрализующая активность такой сыворотки, определяемая методом тит рования на белых мышах, соответствует 1000-2000 ЕР. Сыворотка изготав ливается стерильно, хранится при температуре 4-6°С в течение года.

Техника получения антирабического иммуноглобулина Преципитирующий иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной, без следов гемолиза антирабической сыворотки, используя раствор 53%-ного этанола. Предварительно, для освобождения от термола бильных ингибиторов, сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде (1000-3000 см) в водяной бане 30 минут при температуре 56-58 С.

Сыворотка должна иметь рН 7,0-7,2 и это достигается добавлением 2М аце татного буфера рН 4,65 в количестве 2-6 мл на 1 л. Ацетатный буфер гото вится смешиванием в соотношении 1:1 отдельно приготовленных 2М раство ров уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты.

Сыворотку с установленной рН охлаждают до 0 °С и одновременно ох лаждают до минус 15-20 °С предназначенный для осаждения раствор 53% ного спирта на дистиллированной воде.

В условиях холодильной камеры при температуре 0 С к охлажденной сыворотке медленно, при постоянном перемешивании добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь продолжают перемешивать 30 минут, снижая температуру до минус 5 °С, и оставляют на 16-18 часов для форми рования осадка.

Прозрачную надосадочную жидкость удаляют, выпавшие в осадок им муноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при температуре минус 5 °С.

Осадок глобулина растворяют в охлажденном до 4 °С 0,15М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной (+20+25°С).

Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8 %.

Для коррекции солевого состава и удаления незначительного количест ва спирта раствор иммуноглобулина диализируют против 5М раствора хло рида натрия при четырехкратной его смене при температуре +4 °С в тече ние 2-х суток в целлофановых мешочках. Затем глобулин осветляют от не значительной опалесценции центрифугированием при той же температуре в течение 30 минут при 4000 об/мин.

Иммуноглобулин по фракционному составу состоит из гамма глобулина, со следами бета-глобулина.

Раствор иммуноглобулина доводят до 5 %-ной концентрации 0,5М рас твором хлористого натрия, консервируют мертиолатом 1:5000, исследуют на специфичность и преципитируюшую активность и подвергают лиофильной сушке.

Определение преципитирующей активности и моноспецифичности ан тирабического глобулина.

Преципитирующая активность иммуноглобулина определяется мето дом титрования РДП в агаровом геле. Исследуют 2-кратные разведения гло булина от 1:2 до 1:256 с контрольным положительным антигеном (КПА), приготовленным из головного мозга щенят, павших от интрацеребрального заражения штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля используют антиген, аналогично приготовленный из мозга здоровых щенят.

Положительная реакция отмечается во всех случаях образования линий преципитата любой интенсивности с КПА, причем исходное разведения 1: и 1:4 могут образовать 1-2 линии преципитации. Максимальное разведение преципитата соответствует его преципитирующему титру.

Контрольный отрицательный антиген со всеми разведениями глобули на дает отрицательный результат.

Иммуноглобулин, полученный этим способом имеет преципитиру ющую активность до разведения 1:32 - 1:128, что делает его пригодным для практического применения в качестве ИДАП.

На моноспецифичность иммуноглобулин проверяют в разведениях от 1:2 до 1:256 РДП в агаровом геле с головным мозгом:

- здорового осленка, жеребенка, ягненка, кролика, морской свинки;

- различных не болевших бешенством животных павших от различных вирусных и бактериальных инфекций);

- осленка, жеребенка, ягненка, кролика, морской свинки, белых мы шей, павших в результате интрацеребрального заражения фиксирован ным вирусом бешенства (CVS).

Преципитирующий иммуноглобулин, полученный этим способом, об ладает моноспецифичностью, так как образует преципитат только с антиге ном из мозга животных, зараженных рабической инфекцией.

Метод РДП в агаровом геле с использованием ИДАП является экс пресс методом диагностики бешенства и позволяет обнаружить рабический антиген в первичном патологическом материале в течение 24 часов в 95 и более процентах случаев, загнивание не является препятствием к использо ванию глобулина.

Эффективность способа заключается в получении высокоактивного специфического антирабического иммуноглобулина без использования до рогостоящего оборудования и реагентов, позволяющий изготовить сравни тельно дешевый и эффективный диагностический препарат ИДАП.

Технология получения иммуноглобулина диагностического антирабиче Иммуноглобулин получают путем иммунизации лошадей продуцентов по отработанной нами схеме рабическими антигенами, приготовленными из вируссодержащей мозговой ткани жеребят, получением антирабической сы воротки, выделением иммуноглобулина и мечением флуорохромом.

А. Техника иммунизации животных Для иммунизации отбирают клинически здоровых, упитанных лоша дей, полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным забо леванием хозяйств.

Иммунизацию осуществляют антигеном, приготовленным из вирусосо держащей мозговой ткани жеребят 1,5- 4 месячного возраста. Для этого предварительно жеребят интрацеребрально заражают 1% -ной суспензией вируса бешенства (штамм CVS) в 0,3-0,5 см 3. На 6-7 день в асептических условиях извлекают головной мозг, из которого готовят 4%-ную суспензию на 0,85-ном растворе хлорида натрия.

Животных иммунизируют подкожными и внутримышечными инъек циями антигенов в 2-х вариантах:

А) фенольным с добавлением 0,25% фенола Б) адъювант депонированным с содержанием 0,05% сапонина, 20% гидрата окиси алюминия и 0,1% формалина.

Инъекции выполняют в подлопаточную область, шею и круп, 4-8 крат но, с интервалом 10-20 дней в дозах 10-50 см 3 с соблюдением правил асепти ки и антисептики.

Нарастание титра рабических антител проверяют в пробах сыворотки крови реакции диффузной преципитации (РДП) в агаровом геле с антигеном, приготовленного из штамма СVS.

При достижении преципитационного титра 1:32-1:128 производится взятие крови с интервалом 21 день, первоначально из расчета 400 см 3, а при последующих крововзятиях- 1600 см 3 на 100 кг живой массы.

Сыворотка изготавливается стерильно и сохраняется в условиях холо дильника при температуре 4-6 0 С.

Б. Техника получения антирабического иммуноглобулина.

Преципитирующий иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной без следов гемолиза антирабической сыворотки, используя раствор 53%-ного этанола.

Предварительно, для освобождения от термолабильных ингибиторов сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде (1000-3000 см 3 ) в водяной бане 30 минут при температуре 56-58 С.

Сыворотка должна иметь рН 7,0-7,2 и это достигается добавлением 2М ацетатного буфера рН 4,65 в количестве 2-6 мл на 1 л. Ацетатный буфер го товится смешиванием в соотношении 1:1 отдельно приготовленных 2М рас творов уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты.

Сыворотку с установленной рН охлаждают до 0 С и одновременно охлаждают до минус 15-20 0 С предназначенный для осаждения раствор %-ного спирта на дистиллированной воде.

В условиях холодильной камеры при температуре 0 С к охлажденной сыворотке медленно, при постоянном перемешивании добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь продолжают перемешивать 30 минут, снижая температуру до минус 5 С и оставляют на 16-18 часов для формиро вания осадка.

Прозрачную надосадочную жидкость удаляют, выпавшие в осадок им муноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при температуре минус Осадок глобулина растворяют в охлажденном до 4 С 0,15М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной (+ +25 0 С). Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8 %.

Для коррекции солевого состава и удаления незначительного количест ва спирта раствор иммуноглобулина диализируют против 0,15М раствора хлорида натрия при четырех кратной его смене и температуре +4 0 С в течение 2-х суток в целлофановых мешочках. Затем глобулин осветляют от незначи тельной опалесценции центрифугированием при той же температуре в тече ние 30 минут при 4000 об/мин.

Иммуноглобулин по фракционному составу состоит из гамма глобулина, со следами бета-глобулина.

В. Приготовление флуорисцирующих антител.

Для конъюгации (метки) антител предпочтительнее применять не на тивные сыворотки, а их глобулиновые фракции. Необходимое количество флуорохрома для конъюгации расчитывают по концентрации в препарате белка (0,5-5 мг флуорохрома на 100 мг белка).

В качестве флуорохрома используют изотиоционат флуоресцина (ФИТЦ), максимально поглощающий фиолетово-синие лучи и дающий ярко зеленую флуоресценцию. Для проведения конъюгации фракцию глобулина доводят с помощью 0,01 М забуференного раствора поваренной соли до со держания белка, равного 1 %, а с помощью 0,5 М карбонатного буфера дово дят рН до 9,0. Суспензию охлаждают до 4 0 С и очень медленно прибавляют к ней при постоянном перемешивании красящее вещество. ФИТЦ применяют в количестве 7,5 мг красителя на 10 мл 1 %-ного белка.

После добавления красителя смесь следует оставить на несколько часов (18-22 ч) при температуре 4 0 С для достижения полной конъюгации.

Для удаления неспецифических флуоресцирующих компонентов осу ществляют фильтрацию через сефодекс G – 25. Сефодекс кладут в колонку и промывают его 0,01 М забуференным раствором поваренной соли. Предва рительно отцентрифугированный конъюгат осторожно помещают на сефо декс и заливают соответствующим количеством 0,01 М забуференного рас твора поваренной соли. Очищенный конъюгат собирают в соответствующий сосуд.

Раствор флуорисцирующего иммуноглобулина доводят до 5%-ной кон центрации 0,15М раствором хлористого натрия, консервируют мертиолатом 1:5000, исследуют на специфичность и флуорисцирующую активность и подвергают лиофильной сушке.

Г. Определение флуорисцирующей активности и моноспецифичности антирабического глобулина.

Флуорисцирующая активность иммуноглобулина определяется пря мым методом иммунолюминисцентной микроскопии (ПМИМ).

При диагностике бешенства отпечатки готовят из свежего или свеже мороженного материала аммонова рога, коры полушарий, мозжечка и др., используя при этом тщательно обезжиренные эфиром или спирт-эфиром предметные стекла (лучше специальные для люминесцентной микроскопии, толщиной 1,5 мм). Отпечатки должны быть тонкими, разнослойными. Это достигается тем, что с кусочка ткани, легко прикрепляющегося к фильтро вальной бумаге или тонкой деревянной досточке-шпателю, делают 1-2 гру бых отпечатка на отдельном стекле (они не используются в работе), а затем с той же поверхности кусочков делают отпечатки на отдельные предметные стекла, используемые для люминесцентной микроскопии. С каждого иссле дуемого кусочка мозговой ткани необходимо сделать не менее 4 отпечатка на 2 стекла.

Для контроля аналогично приготавливают препараты из мозга здоро вых животных (можно использовать для этого мозг всяких животных, не бо левших рабической инфекцией). Препараты после высушивания на воздухе в течение 3-5 минут фиксируют в ацетоне при +12 0 С в течение 4 часов-при работе с уличным вирусом бешенства и 10 минут – при работе с вакцинным вирусом-фикс.

По мере надобности вскрывают ампулу с ДАФИ, ее содержимое рас творяют в 1мл дистиллированной воды (основное разведение, рН 7,2-7,4), а затем постепенно добавляя физиологический раствор хлорида натрия, или фосфатнобуферный раствор (рН 7,2-7,4), доводят общий объем иммуногло булина до объема, создающего «рабочее разведение». Рабочее разведение ДАФИ не должно содержать даже мельчайших количеств визуально видимо го осадка или хлопьев препарата. Рабочее разведение ДАФИ годно к приме нению в течение 2-х недель после приготовления, при условии хранения в темном месте при температуре +4 0 С (+ - 2 0 С) в хорошо укупоренной склянке и при условии сохранения исходной полной его растворенности.

На фиксированные в ацетоне препараты-отпечатки наносят каплями приготовленный в «рабочем разведении» ДАФИ, покрывая им весь препарат (отпечаток). Затем препараты (предметные стекла) помещают во влажную камеру, например, чашку Петри или закрытый эмалированный лоток, обыч ный стерилизатор, с увлажненным дном и тампонами влажной ваты и вы держивают 20-30 минут при температуре от +25 до +37 0 С, затем в течение часа отмывают в 2 сменах 0,01 М фосфатно-буферного раствора (рН 7,2-7,4), осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на возду хе. После такой подготовки препараты-отпечатки вполне готовы для иссле дования.

П р и м е ч а н и е : Указанное на этикетке «рабочее разведение» ДАФИ установлено на день выпуска препарата и определяется по мере хранения че рез каждые 3 месяца или при возникающей в этом надобности_ в связи с возможностью снижения препаратом активности. «Рабочее разведение» ука зывает во сколько раз надлежит развести 1 мл основного разведения ДАФИ, чтобы его раствор был годен к использованию в работе. Указанное на эти кетке «рабочее разведение» в 2-3 раза более концентрированное, в сравнении с «красящим титром». Красящий титр - максимальное разведение исходного разведения ДАФИ, сообщающее рабическому антигену в препаратах отпе чатках, специфическое свечение интенсивностью в 3-4 креста.

При установлении «красящего титра» раствора ДАФИ препараты отпечатки из мозга животных (кроликов, морских свинок, белых мышей), павших от фиксированного вируса бешенства, красят в течение 30 минут при +37 0 С.

Микроскопия проводится с помощью люминесцентного микроскопа любого типа- МЛ-1, МЛ-2, МЛ-4 и др. с возбуждающими фильтрами ЖС- + ЖЗС-19. Препараты просматривают под иммерсией. При этом используют нелюминесцирующее масло. Учитывают результаты визуально на основе оценки интенсивности свечения и морфологических особенностей светяще гося комплекса «антиген-антитело».

Обычно наблюдают следующую картину: непораженная вирусом бе шенства, свежая незагнившая мозговая нервная ткань (свободная от рабиче ского антигена) светится тусклым серовато-желтым или слегка зеленоватым цветом: интенсивно светящихся желто-зеленых гранул и «песчинок» нет. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдаются разной величины и формы гранулы (в нейронах и вне клеток), которые желто зеленые интенсивно светятся. Их величина колеблется от едва заметных в виде «песчинок» образований до 15 –20 микронов. Чаще отмечается обилие очень мелких «песок» ярко желто-зеленых частиц, размером до 1 микрона, реже выявляются более крупные гранулы-до 4 микронов округлой и оваль ной формы;

и еще более крупные (6-15 микронов) округлые или овальные включения.

Интенсивность свечения оценивают в крестах:

«4+» - яркая, светящаяся желто-зеленая люминесценция гранул и мель чайших точек-песчинок;

«3+» - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая люми несценция гранул и мельчайших точек;

«2+» - неяркая люминесценция желтого цвета;

«1+» - слабая люминесценция, обнаруживаемая только в крупных включениях, желто-серого цвета;

«-» - отсутствие специфической люминесценции.

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживается достаточное количество (не менее 10) типичных гранул (мелких, средних или крупных) или – скоплений групп мельчайших точек («песок») в нервных клетках или вне их, с ярким желто зеленым свечением, при условии отсутствия в контроле подобных светящих ся гранул.

При отрицательном диагнозе на бешенство, устанавливаемом методом иммунолюминесцентной микроскопии, ставят биопробу на молодых белых мышах, согласно существующих наставлений, мозг от погибших мышей ис следуют методами иммунолюминесцентной микроскопии или РП в агаровом геле.

Эффективность способа заключается в получении высокоактивного флуоресцирующего антирабического иммуноглобулина без использования дорогостоящего оборудования и реагентов и позволяющий изготовить срав нительно дешевый и эффективный диагностический препарат «ИДАФ».

Иммуноферментный анализатор бешенства на мембранном сорбенте Сущность метода: на нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45нм («Sartorius») с помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуе мого материала (взятого от подозреваемых в заражении бешенством живот ных, предположительно содержащего рабический антиген) в разведении 1:100 и выше в 0,9% физиологическим растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем рас творе (1% БСА в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) в присутствии 0,05% детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмы вают промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трис НСІ буферного раствора с рН 7,4, 0.05% Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной получен ной нами гипериммунной антирабической сывороткой, разведенной буферным раствором для сыворотки (10% цельной лошадиной сыворотки в 0,01М трис буферном растворе рН 7.4, 0,05% Твин-20) и инкубируют в тече ние 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, разведенного в буфер ном растворе для сыворотки (1:100-1:400) и инкубируют в течении 30-60 мин 37 С, после чего иммуносорбент отмывают ПБР от несвязавшегося конъю гата. Реакцию проявляют путем обработки иммуносорбента раствором суб страта (0,03% бензидин в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) при окислении которого формируются нерастворимый хромогенный комплекс.

При этом в качестве окислителя используют 0,003 % раствор Н2О2. Резуль тат: положительная реакция на антиген проявляется в виде четко окрашен ных пятен на иммуносорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызыва ет появление окрашенных пятен на иммуносорбенте.

1. Техника получения антигена.

Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют жеребят 1,5-4-месячного возраста, матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см3 1 %-ной суспензией вируса бешенства (штамм «овечий» ВГНКИ). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком, после чего готовится 10 % суспен зию на 0,85 % растворе хлорида натрия, с добавлением антибиотиков из рас чета но 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 см3. Суспензию экстра гируют в течение 18 часов при 4°С и из надосадочной жидкости делают раз ведение 1:10, которое и используют для заражения.

На 5-6 день, когда у жеребят наступает атаксия, параличи и агония, в асептических условиях извлекают головной мозг. Хранят мозг целиком в стерильной посуде при температуре минус 20 °С и используют по мере на добности.

Рабический антиген для иммунизации лошадей применяют в 2-х ва риантах, основу которых составляет 4%-ная суспензия вирулентного мозга жеребенка на физиологическом растворе хлорида натрия.

Добавление к одной части суспензии 0.25 % фенола образует феноль ный антиген. Другой - адъювант-депонированный антиген содержит в своем составе 0,05 % сапонина, 20 % гидрата окиси алюминия и 0,1 % формалина.

2. Техника иммунизации животных.

Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здо ровых, упитанных лошадей, полученных из благополучных по инфекцион ным, инвазионным заболеваниям хозяйств.

Иммунизацию животных осуществляют подкожными и внутримыш ечными инъекциями рабических антигенов в области шеи и крупа. Объем вводимого материала делят на несколько порций и вводят в разные участки тела. Животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10-20 дней в зави симости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и антисепти ки. Вначале вводят адъювант-депонированный антиген в дозе 10 см3, кото рый повторяют ежемесячно. Фенольный антиген вводят каждые 2 недели в возрастающих дозах от 10 до 50 см.

Нарастание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и РН.

На 10 день после последний инъекции антигена у лошадей осуществ ляют пробное крововзятие с забором крови из расчета 400 см с 100 кг жи вой массы тела.

При достижении преципитационного титра 1:32- 1:128 через 21 день производится следующее крововзятие по полной производственной норме (1800 см3 на 100 кг живой массы). Вируснейтрализующая активность такой сыворотки, определяемая методом титрования на белых мышах, соответст вует 1000-2000 ЕР.

Сыворотка изготавливается стерильно, сохраняется в условиях холо дильника при температуре 4-6 °С и в течение года используется для диагно стических целей.

3. Постановка реакции.

На нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45нм («Sartorius») с помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого материала (взя того от подозреваемых в заражении бешенством животных, предположи тельно содержащего рабический антиген) в разведении 1:100 и выше в 0,9% физиологическом растворе, после чего высушивают при комнатной темпера туре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физио логическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1% БСА в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) в присутствии 0,05% детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывали промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трис-НСІ буферного рас твора с рН 7,4, 0.05% Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывали лист хроматографической бумаги, пропитанной полученной нами гиперим мунной антирабической сывороткой, разведенной буферным раствором для сыворотки (10% цельной лошадиной сыворотки в 0,01М трис буферном рас творе рН 7.4, 0,05% Твин-20) и инкубировали в течение 15-60 мин. После по вторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывали лист хрома тографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, ме ченных пероксидазой хрена, разведенного в буферном растворе для сыворот ки (1:100-1:400) и инкубировали в течении 30-60 мин 37 С, после чего им муносорбент отмывали ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию прояв ляли путем обработки иммуносорбента раствором субстрата (0,03% бензидин в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) при окислении которого фор мировался нерастворимый хромогенный комплекс. При этом в качестве окислителя использовали 0,003 % раствор Н2О2. Результат: положительная реакция на антиген проявлялась в виде четко окрашенных пятен на иммуно сорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызвала появление окрашен ных пятен на иммуносорбенте.

4. Эффективность способа.

В ходе разработки техники постановки иммуноферментного метода ус тановлено, что максимальный титр антирабической сыворотки составлял 1:102400 при концентрации рабического антигена -1 мкг/точка. Детекция минимального количества рабического антигена 0.0001 мкг/точка происхо дила при разведении антирабической сыворотки 1:400-1:800. Однако при разведении антирабической сыворотки 1:400-1: 800 появлялось неспецифи ческое связывание с антигенами нормальной лошадиной сыворотки в кон центрации 1мкг/точка.

Таким образом, детекция специфического иммунного комплекса про исходила при разведении антирабической сыворотки 1:1600-1:13200. Исходя из этого, за рабочую дозу антирабического сыворотки брали разведение сы воротки, позволяющее осуществлять детекцию рабического белка в концен трации 1нг/ точка (Табл.1).

Установлено, что через 3 минуты инкубации антигена с моноспецифи ческой, антирабической сыворотки на НМ начинали появляться комплексно «антиген-антитело». Интенсивность окраски пятен возрастала к 60-ой мину те, далее оставалось на одном уровне.

Влияние инкубации комплекса антиген-антитело с конъюгатом на эф фективность проявление пятен изучали с помощью различных концентрации антигена вируса бешенства с антирабической сыворотки и нормальной ло шадиной сывороткой в разведении 1:600 (Табл.2). При 30 минутой инкуба ции в 37С, детекция белка составляла 0.01мкг, а при 60 минутной 0.001мкг/точка. Дальнейшее увеличение времени инкубации не влияло на чувствительность метода.

Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК Бешенство вызывается вирусом с аналогичным названием: вирус бе шенства (Rabies virus), представителем рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae. Род Lyssavirus объединяет семь генотипов. Генотип 1 пред ставлен классическими штаммами вируса бешенства (rabies virus), которые циркулируют во всем мире. Генотипы 2-7 включают rabies-related (non-rabies) вирусы: Lagos bat virus (генотип 2), Mokola virus (генотип 3), Duvenhage virus (генотип 4), European bat lyssavirus 1 (EBLV1) и 2 (EBLV2) (генотипы 5 и соответственно) и Australian bat lyssavirus (генотип 7). Вирус бешенства (ге нотип 1) поддерживается в природе межвидовой передачей практически по всеместно (кроме Австралии и некоторых островов) среди представителей Carnivora и Microchiroptera.

Геном представлен единой 1-спиральной линейной молекулой минус РНК состоит из 11932 нуклеотидов. Вирионная РНК рабдовирусов не обла дает инфекционностью. В вирионах рабдовирусов обнаружено 5 полипепти дов (гликопротеин G, матриксный белок М, нуклеопротеин N, фосфопротеин NS, обратная транскриптаза L (РНК-зависимую РНК-полимераза)), 3 из кото рых (L, NS, N) связаны с нуклеокапсидом, а 2 (G, М) входят в состав липо протеидной оболочки. Белок G гликозилирован, образует на поверхности ви риона выступы и индуцирует синтез вирус нейтрализующих антител и обес печивает развитие иммунитета. Белки нуклеокапсида N и NS имеют группос пецифические антигенные детерминанты. Белки нуклеокапсида L и NS яв ляются компонентами транскриптазы. Гены расположены в следующем по рядке: 3'-N-NS-M-G-L-5'.

Одним из широко используемых методов детекции РНК вируса бешен ства является обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ ПЦР) (Nadin-Davis SA, Huang W, Wandeler AI. The design of strain-specific polymerase chain reactions for discrimination of the racoon rabies virus strain from indigenous rabies viruses of Ontario. J Virol Methods. 1996 Mar;

57(l):l-14). С помощью ПЦР диагноз можно поставить за 8 часов. Кроме того, применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изоля тов в течение 16 часов.

В большинстве случаев ПЦР применяют для штаммовой дифференциа ции вируса бешенства. В частности, применена ПЦР для дифференциации штаммов вируса бешенства енотов от местных вирусов бешенства, циркули рующих в Онтарио. Использование праймеров к гену нуклеопротеина в мультиплексной ПЦР позволило быстро дифференцировать бешенство ено тов от изолятов других видов животных из Онтарио и в соответствии с этим принимать меры борьбы. Кроме этого, возможно применение ОТ-ПЦР для прижизненного обнаружения вирусной РНК. Известна возможность выделе ния РНК в слюне инфицированных животных и в биоптате слюнной железы.

Создан набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации виру са бешенства в полевых и клинических образцах, имеющего следующую структуру:

Конструирование праймеров осуществлялось путем сравнения нуклео тидных последовательностей различных штаммов лиссавирусов, депониро ванных в международной базе данных Gene Bank.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием большого числа изолятов вируса бешенства, выделенных от различных видов диких и домашних животных на территории Новосибирской области, Алтайского и Красноярского края. Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса бешенства в образцах головного мозга обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера (558 п.о.) в условиях ОТ ПЦР. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геном ной РНК Праймеры фланкируют консервативный участок гена нуклеопротеина вируса бешенства, кДНК который не имеет полиндромных повторов нуклео тидов и не образует выраженных вторичных структур, не имеет протяженных G-C участков. Для пар праймеров расчетная температура плавления была близкой и составила Tm=52°С. Специфичность образующегося фрагмента кДНК устанавливали прямым секвенированием полученного фрагмента, ис пользуя праймеры Rab134F и Rab1292R, Rab299F и Rab857R, что и было вы полнено для большого количества штаммов и изолятов вируса бешенства, выделенных в Новосибирской области от больных бешенством животных.

Технология иллюстрируется следующими примерами.

1. Выделение РНК вируса бешенства из образцов головного мозга больных бешенством животных.

Для оценки эффективности использования нашего изобретения было исследовано 132 образца головного мозга от различных видов диких и до машних животных. О наличии в исследуемом материале вируса бешенства судили на основании результатов МФА и биологической пробы.

В качестве положительного контроля был использован вирус бешенст ва штамма CVS.

Кроме этого, было проведено исследование материала от летучих мы шей. Суммарно было отловлено 52 летучие мыши видов Myotis daubentonii Kuhl, 1819, Myotis brandtii Eversman, 1845, Murina leucogaster Milne-Edwards, 1872, Plecotus auritus L., 1758.

После первичного анализа мозга летучих мышей на наличие антигена лиссавируса в МФА положительные пробы исследовали методом ОТ-ПЦР.

100mg мозговой ткани гомогенизировали в 200µl 3М ацетата натрия (рН 5.2). К образцам добавляли 10 объемов RNAzol® (GibcoBRL) и инкуби ровали при 65°С в течение 15 мин., затем добавляли 300µl хлороформа и от деляли водную фазу, эту процедуру повторяли дважды. Добавляли 500µl ох лажденного изопропанола, центрифугировали при 14000 об/мин 20 мин при 4°С (Hermle Z233 МК-2, Германия). Выделенную РНК отмывали 70% этано лом.

2. Получение кДНК методом обратной транскрипции.

К сухому осадку, содержащему выделенную РНК, добавляли следую щую смесь: по 10 нмоль каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, l,5mM MgCl2, 10mМ Трис-HCl (рН 8,3 при +25°С), 50mM NaCl, 0,01M дитиотрейто ла и 25 пмоль специфической затравки. Синтез кДНК проводили при +37°С час с 50 ед. M-MulV (Boehringer Mannheim).

3. Проведение полимеразной цепной реакции.

Использовали следующие параметры ПЦР: 94°С 10 с, 56°С 30 с с по нижением температуры на 1°С за цикл, 72°С 1 мин - 6 циклов, затем 94°С с, 50°С 15 с, 72°С 30 сек 35 циклов. Завершающий синтез проводили 7 мин 72°C «Eppendorf Mastercycler Gradient», Германия). Праймеры Rab134F и Rab1311R использовали для первого раунда ПЦР, праймеры Rab299F и Rab877R - для второго раунда. В качестве реакционного буфера для ОТ-ПЦР использовали: 30 мМ Tris-HCl (pH 8,5 при ±25°С);

16 мМ (NH4)2SO4;

1,5 мМ MgCl2;

0,1% Nonidet P40;

по 160 µМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP;

no 0,15 µМ олигонуклеотидов;

0,35 ед. Taq-ДНК полимераза («СибЭнзим», Россия).

4. Определение нуклеотидной последовательности.

Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System»

(«Beckman Coulter, Inc.») по методу Sanger et al. [9] согласно инструкции к «Beckman sequencing Kit». Нуклеотидные и выведенные аминокислотные по следовательности были анализированы с использованием программы MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США).

Результат исследований: у полученных ПЦР-продуктов (558 пар нук леотидов) были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности.

Специфичность набора праймеров была подтверждена при исследова нии заведомо положительных образцов, прямым секвенированием получен ного ПЦР-фрагмента.

В результате вакцинации происходят биохимические изменения, обу словливающие снижение чувствительности нервных клеток к вирусу. Не подлежит сомнению и защитная роль вируснейтрализующих антител, про дукцию которых активно стимулирует вакцина. При заражении иммунизиро ванных животных особенно заметна роль антител, нейтрализующих вирус в месте его внедрения.

Для создания искусственного активного иммунитета наибольшее рас пространение со времен Пастера приобрел метод, основанный на использо вании полностью или частично инактивированного фиксированного вируса бешенства.

Пастер с учениками Ру и Шамберланом (1881—1885) установили воз можность ослабления вируса бешенства пассированием его через мозг кро ликов (внутримозговым заражением). При этом вирус приобрел постоянную вирулентность для кроликов при внутримозговом заражении, утратив ее при иных способах инфицирования. В отличие от эпизоотических штаммов этот вирус, вызывающий у кроликов бешенство после короткого инкубационного периода, имеющего постоянный, фиксированный срок, равный семи суткам, стали называть по предложению Пастера фиксированным вирусом бешенст ва. Этот штамм широко используется для изготовления вакцин во многих странах мира.

В 1885 г. Пастер впервые применил вакцину (взвесь спинного мозга кролика, заболевшего паралитическим бешенством после субдурального за ражения фиксированным вирусом бешенства) для лечебной иммунизации человека.

Все известные вакцины можно разделить на вакцины из ткани мозга;

авианизированные вакцины, т. е. вакцины, приготовленные на эмбрионах кур или уток, и культуральные вакцины. По характеру изготовления различают также жидкие и лиофилизированные вакцины, а по степени жизнеспособно сти вируса — живые и инактивированные. Последние можно подразделить на инактивированные химическими веществами и физическими факторами или получаемые под воздействием комплексов тех и других факторов.

В США широко применяли вакцину из ткани эмбрионов уток. Предло жены культуральные антирабические вакцины, которые готовят из штаммов вируса-фикс бешенства, адаптированного к культуре диплоидных клеток че ловека, первичным культурам клеток почек сирийского хомяка и почек эм бриона коровы.

К числу вакцин, ранее широко применяемых в мировой практике, от носят вакцину Семпла, которую готовили из вируса-фикс бешенства, выра щенного в мозге кролика и инактивированного фенолом при 37°С, вакцины из мозга новорожденных животных с вирусом-фикс бешенства, инактивиро ванным ультрафиолетовыми лучами или бета-пропиолактоном, сухую фе нолвакцину типа Ферми из мозга овец и некоторые другие.

Ранее широко использовали тканевую сухую антирабическую фенол вакцину (типа Ферми). Большинство антирабических вакцин не содержало инфекционного вируса, однако в некоторых препаратах типа Ферми допус калось присутствие «остаточного» вируса (до 2,0 и 3,0 lg ЛД50 в 0,03 мл), ко торый при определенных условиях может быть причиной возникновения по ствакцинальных неврологических осложнений.

В современной биотехнологии антирабических вирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы (Внуково-32, Щелково-51, Тс-80, РВ-97 и др.), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ВНК-21, ПС, Vero., и др., применяя различные методические приемы культивирования - стационарный, роллерный, суспензионный.

Приготовление вакцины. Для приготовления сухой антирабической фенолвакцины используют мозг овец, зараженных вирусом-фикс бешенства.

Производственный штамм ГНКИ представляет собой ответвление ори гинального штамма Пастера, который прошел 83—85 пассажей на овцах при интрацеребральном заражении. ВГНКИ ветпрепаратов ежегодно рассылает этот штамм в сухом виде с соответствующим паспортом на биопредприятия страны, выпускающие антирабические вакцины. Во ВГНКИ штамм пассиру ют на овцах 1 раз в год. Штамм ГНКИ, используемый в производстве анти рабических вакцин, должен обладать следующими свойствами:

- вызывать типичную картину заболевания «лабораторной» формой па ралитического бешенства после инкубационного периода продолжительно стью у овец не менее 80 ч и не более 120 ч, у кроликов— 80—96 ч;

- быть вирулентным при интрацеребральном заражении белых мышей массой по 10—14 г в титре не менее 5,5 lg ЛД50 в 0,03 мл;

при подкожном введении в области верхней губы — не выше 2,8 lg ЛД.50в 0,5 мл;

- вызывать при подкожном введении 5 мл 10%-ной вируссодержащей мозговой суспензии заболевание не более чем у 1 кролика из 10 массой по 2—2,5 кг;

- нейтрализоваться специфической антирабической сывороткой или антирабическим гамма-глобулином.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |
 




Похожие материалы:

«ИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.Н.АХМЕТСАДЫКОВ Г.С.ШАБДАРБАЕВА Д.М.ХУСАИНОВ ТЕХНОЛОГИЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ (Рекомендован МОН РК) Алматы, 2013 1 УДК ББК Х Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М. Технология ветеринарных лекарственных препаратов: Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М. Технология ветеринарных лекарственных препаратов //Учебник – Алматы: Нурпринт, 2013 – 283 с. ISBN В учебнике ...»

«КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.П.ИВАНОВ доктор ветеринарных наук, профессор, академик НАН РК К.А.ТУРГЕНБАЕВ доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. КОЖАЕВ кандидат ветеринарных наук ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ Том 3 Болезни жвачных животных, свиней и лошадей Алматы, 2012 УДК 619:616.981.42 (075.8) ББК 48.73Я73 И22 Учебное пособие рассмотрено и рекомендовано к изданию Ученым Сове том факультета Ветеринарной медицины и биотехнологии КазНАУ (протокол № 7 от 26 июня 2009 г.). \ ...»

«КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Н.П.ИВАНОВ доктор ветеринарных наук, профессор, академик НАН РК К.А.ТУРГЕНБАЕВ доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. КОЖАЕВ кандидат ветеринарных наук ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ Том 1 Общая эпизоотология Алматы, 2012 УДК 619:616.981.42 (075.8) ББК 48.73 я73 И22 Учебное пособие рассмотрено и рекомендовано к изданию Ученым Со ветом факультета Ветеринарной медицины и биотехнологии КазНАУ (протокол № 7 от 26 июня 2009 г.). Иванов Н.П. и др. И 22 ...»

«ОТДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И НАУК ИНСТИТУТ МАТЕМАТИЧЕСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ПОЧВОВЕДЕНИЯ РАН ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ РАН Российский фонд фундаментальных исследований Материалы Второй Национальной конференции с международным участием Математическое моделирование в экологии 23-27 мая 2011 г. г. Пущино УДК 57+51-7 ББК 28в6 М34 Ответственный редактор профессор, доктор биологических ...»

«Флора и фауна заповедников 65 Флора и фауна заповедников Комиссия Российской академии наук по сохранению биологического разнообразия (С екция заповедного дела) Федеральное государственное бюджетное учреждение Мордовский государственный природный заповедник имени П. Г. Смидовича ФЛОРА И ФАУНА ЗАПОВЕДНИКОВ Вып. 120 ПОЗВОНОЧНЫЕ ЖИВОТНЫЕ МОРДОВСКОГО ЗАПОВЕДНИКА Москва 2012 1 Позвоночные животные Мордовского заповедника ВЫПУСКИ КУРИРУЮТ: д.б.н. К. Л. Виноградова (низшие растения); д.б.н. В. С. ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ О Б Р А З О В А Т Е Л Ь Н О Е У Ч Р Е Ж Д Е Н И Е ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н. II. ОГАРЕВА Е. В. МОКШИН, А. С. ЛУКАТКИЫ ПОСТАНОВКА НАУЧНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ САРАНСК ИЗДАТЕЛЬСТВО МОРДОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2011 У Д К 57.084(075.8) ББКЕ5 М749 Рецензенты: кафедра микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ, НАУКИ И КАДРОВ - УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ БЕЛОРУССКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПОЛИТИЧЕСКОЕ И СОЦИАЛЬНО- ЭКОНОМИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ: ИСТОРИЯ И СОВРЕМЕННОСТЬ Сборник научных статей по материалам академической научной конференции студентов и магистрантов (Горки, 21 ноября – 6 декабря 2012 г.) Горки БГСХА 2013 МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ ...»

«БРЯНСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОГО ФИЛОСОФСКОГО ОБЩЕСТВА БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОГО АНТРОПОСОЦИАЛЬНОГО ПОЗНАНИЯ Сборник статей Выпуск 5 Под общей редакцией доктора философских наук Э.С. Демиденко Брянск Издательство БГТУ 2007 ББК 87.6 П 78 Проблемы современного антропосоциального познания: сб. ст. / под общей ред. Э.С. Демиденко. – Брянск: БГТУ, 2007. – Вып. 5. – 275 с. ISBN 5-89838-303-4 Рассматриваются актуальные темы и проблемы современной ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ БРЯНСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОГО ФИЛОСОФСКОГО ОБЩЕСТВА ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОГО АНТРОПОСОЦИАЛЬНОГО ПОЗНАНИЯ Сборник статей Выпуск 10 Под общей редакцией доктора философских наук Н.В. Попковой Брянск Издательство БГТУ 2012 ББК 87.6 П 78 Проблемы современного антропосоциального познания [Текст]+[Электронный ресурс]: сб. ст. / под общей ред. Н.В.Попковой. – Брянск: БГТУ, 2012. – Вып. 10. ...»

«ПЛАНЕТА ЗЕМЛЯ: АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕОЛОГИИ ГЛАЗАМИ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ И СТУДЕНТОВ Материалы российской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной Году Планеты Земля Москва, 6-7 апреля 2009 г. Том 3 Геология и геохимия твердых полезных ископаемых Экологическая геология Общие вопросы геофизики Издательство Московского университета 2009 УДК 55 ББК 26 П37 Печатается по решению Ученого совета Геологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Редколлегия: А.В.Бовкун, В.О.Япаскурт, ...»

«ПЛАНЕТА ЗЕМЛЯ: АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕОЛОГИИ ГЛАЗАМИ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ И СТУДЕНТОВ Материалы российской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной Году Планеты Земля Москва, 6-7 апреля 2009 г. Том 2 Актуальные проблемы геохимии Инженерная геология. Геокриология. Гидрогеология Издательство Московского университета 2009 УДК 55 ББК 26 П37 Печатается по решению Ученого совета Геологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Редколлегия: А.В.Бовкун, В.О.Япаскурт, А.Ю.Бычков, ...»

«Перчик ТРУБОПРОВОДНОЕ ПРАВО Под редакцией И.Г. Ларина Москва 2002 УДК 622.691.4 Перчик А.И. Трубопроводное право. – М.: Нефть и газ, 2002. – 368 с. В книге впервые в систематизированном виде изложены нормы и институты трубопроводного права, которое рассматривается в качестве подотрасли комплексной отрасли – транспортное право. Дано определение предмета, метода и источников трубопроводного права, большое место уделено вопросам государственного регулирования магистрального трубопроводного ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Департамент научно-технологической политики и образования Министерство сельского хозяйства Иркутской области Иркутская государственная сельскохозяйственная академия НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СТУДЕНТОВ В РЕШЕНИИ АКТУАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ АПК Материалы студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 80-летию ФГБОУ ВПО ИрГСХА (19-20 марта 2014 г., г. Иркутск) Часть II Иркутск, 2014 1 УДК 001:63 ББК 40 Н 347 Научные исследования студентов в ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ    Уральский государственный экономический университет                Ю. А. Овсянников, Я. Я. Яндыганов  ПРОГНОЗИРОВАНИЕ  И ПЛАНИРОВАНИЕ  ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ                              Екатеринбург  2008  ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Уральский государственный экономический университет Ю. А. Овсянников, Я. Я. Яндыганов ПРОГНОЗИРОВАНИЕ И ПЛАНИРОВАНИЕ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ Рекомендовано Учебно-методическим советом Уральского государственного ...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Иркутский государственный университет А. В. Болотов БИОЛОГИЯ РАЗМНОЖЕНИЯ И РАЗВИТИЯ Раздел. БИОЛОГИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ Учебное пособие УДК 591.3(075.8) ББК 28.63я73 Б79 Печатается по решению ученого совета биолого-почвенного факультета ИГУ Рецензенты: канд. мед. наук А. А. Бочкарёв (Иркут. филиал ФГОУ ВПО РГУФКСМиТ) канд. биол. наук ...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ АЛЕКСЕЯ ИВАНОВИЧА КУРЕНЦОВА A. I. Kurentsov's Annual Memorial Meetings _ 2010 вып. XXI УДК 92 ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ЭНТОМОЛОГ И ГЕОГРАФ ЛЮДМИЛА ДМИТРИЕВНА ФИЛАТОВА А.Н. Купянская, С.А. Шабалин Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток Приводятся сведения о дальневосточном энтомологе и географе, первом исследователе жуков-стафилинид (Coleoptera: Staphylinidae) Приморского края Людмиле Дмитриевне Филатовой (1941–1998). Дан список публикаций Л.Д. Филатовой. Людмила Дмитриевна ...»

«Общественная палата Российской Федерации Комиссия Общественной палаты РФ по экологической политике и охране окружающей среды Муниципальное управление в сфере охраны окружающей среды (законодательство и практика его применения) ответственный редактор м.и. васильева Москва 2007 УДК 349.6 ББК 67.407 В 19 Авторский коллектив: М.И. Васильева, профессор кафедры экологического и земельного права юридического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, д.ю.н. — Введение; Глава 1; §2 Главы 4 (в соавт. с Т.В. ...»

«Московская финансово-промышленная академия Мирзоян Н.В. Оценка стоимости недвижимости Москва, 2005 УДК 332.6 ББК 65.422.5 М 521 Мирзоян Н.В., Оценка стоимости недвижимости. / Московская финансово-промышленная академия. – М., 2005. – 199 с. © Мирзоян Н.В., 2005 г. © Московская финансово-промышленная академия, 2005 г. 2 Содержание ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ОЦЕНКИ НЕДВИЖИМОСТИ ГЛАВА 2. ОСОБЕННОСТИ ОБЪЕКТА НЕДВИЖИМОСТИ В КАЧЕСТВЕ ОБЪЕКТА ОЦЕНКИ ГЛАВА 3. ИНФОРМАЦИОННОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРИ ...»

«Академия управления при Президенте Республики Беларусь Система открытого образования Основы идеологии белорусского государства Курс лекций В двух частях Часть I 2-е издание, стереотипное Минск 2005 2 УДК 321 (476) ББК 66 О75 Серия основана в 2001 году Авторcкий коллектив: доктор юридических наук, профессор Князев С.Н. (общ.ред.), доктор политических наук, профессор Решетников С.В. (предисловие; гл.1,15; приложение; общ.ред.), доктор исторических наук, профессор Сташкевич Н.С. (гл. 2), доктор ...»






 
© 2013 www.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.